INTRODUCCIÓN

Los enzimas son catalizadores de reacciones químicas en los seres vivos con eficiencia y especialidad extraordinaria. En el proceso de la reacción que catalizan, éstas aceleran la aproximación de una reacción a su equilibrio, sin cambiar la posición de ese equilibrio. Es decir, los enzimas como catalizadores biológicos son tan efectivos que la mayor parte de las reacciones que ellas catalizan no se efectuarían en su ausencia dentro de un tiempo razonable sin que se dieran extremos de la temperatura, presión o pH. Cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos.

En la presente práctica trabajaremos con la enzima amilasa que actuará sobre su sustrato el almidón, dando como producto la glucosa.

La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosa unidas por enlaces α-C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de éstos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La α-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos.

Para medir la actividad enzimática de la α-amilasa, se usara un test colorimétrico que detecta el almidón. Para ellos se contara con una solución de iodo/ioduro de potasio , ya que el almidón en presencia de ésta solución adquiere una coloración azulada característica. Esto tiene una explicación física: El iodo se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones hidrofóbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la α-amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en presencia de ya no dará una coloración azul.

OBJETIVO

Determinar la actividad enzimática de la amilasa, observando si existe sustrato residual o producto.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para ésta práctica utilizamos solución de almidón 1% pH 6.9, solución de NaCl 0.1 M, HCl 0.05 N, solución yodada, reactivo de Benedict cualitativo, solución de α-amilasa al 1%.

1° CUADRO: SISTEMA DE INCUBACION:

REACTIVOS	TUBOS DE ENSAYO
REACTIVOS	I A (mL)	II A (mL)
Solución de almidón bufferado al 1%	5	5
Cloruro de sodio 1 M	1	1
Agua destilada	4	3
Colocamos ambos sistemas de reacción en baño maría a 37°C por 5 minutos.
α – amilasa	----	1
Sometemos a incubación a 37°C por 15 minutos

2° CUADRO: EVALUACIÓN DEL SUSTRATO RESIDUAL:

REACTIVOS	TUBOS DE ENSAYO
REACTIVOS	I B (mL)	II B (mL)
HCl 0.05 N	5	5
De los tubos I y II de la etapa “A” transferir a:	0.5	0.5
Solución yodada	0.5	0.5
Mezclamos uniformemente los contenidos de los sistemas de reacción, observar el color resultante en cada sistema de reacción.

3° CUADRO: DETERMINACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LA REACCIÓN:

REACTIVOS	TUBOS DE ENSAYO
REACTIVOS	I C (mL)	II C (mL)
De los tubos I y II de la etapa “A” transferir a:	1	1
Benedict cualitativo	5	5
Sometemos los contenidos en los tubos de ensayo a ebullición por 10 minutos. Al término del tiempo mezclamos uniformemente, observamos el color de los contenidos en ambos sistemas de la reacción.

RESULTADOS

1° CUADRO: TUBO I A y II A
En el tubo I A y II A se agrega el almidón (sustrato), el cloruro de sodio y el agua destilada; pero en el tubo II A se va agregar α-amilasa (enzima).
Con estos dos tubos posteriormente demostraremos si hay producto (glucosa) o sustrato residual.

2° CUADRO: TUBO I B y II B

En el tubo I B con ayuda de la solución yodada hay cambio de color a azul, con esto se demuestra que en el tubo I A no hubo α-amilasa (enzima) para que actúe con el almidón (sustrato).

En el tubo II B no hay un cambio a azul, osea la solución yodada se quedó sin reaccionar por esto tiene un color amarillo; esto demuestra que en el tubo I A hay una enzima que actúa con el sustrato, por lo tanto va haber producto y no sustrato residual.

3° CUADRO: TUBO I C y II C

En el tubo I A no hay presencia de enzima por lo tanto en el tubo I C no se observará producto, y se demuestra con el Benedict cualitativo, que a elevada temperatura (ebullición) no cambia de color.

En el tubo II A hay un enzima que al actuar con el sustrato se forma la glucosa (producto), y esto se demuestra con el Benedict cualitativo, que al ser sometido a ebullición formó un precipitado color rojo ladrillo.

DISCUSIÓN

En esta práctica usamos: La solución de almidón bufferado (sustrato) que sirve como amortiguador para evitar los cambios de pH, Cloruro de sodio da el pH adecuado para la enzima, la α-amilasa es la enzima que reacciona con su sustrato almidón, y es la que rompe enlaces que sostienen a la glucosa, el ácido clorhídrico que condiciona el pH, la solución yodada usada para determinar la presencia de almidón y el Benedict cualitativo usado para identificar azúcares reductores.

Entonces logramos identificar como una enzima actúa sobre el almidón, y nos ayuda a entender mejor como estas enzimas actúan en nuestro cuerpo.

Con la presencia de la enzima amilasa, que va a hidrolizar al almidón rompiendo sus enlaces; en esta práctica comprobamos que estos enlaces se rompieron y formaron glucosa.

Pudimos identificar cómo en ausencia de amilasa, y sólo con el almidón se forma el sustrato residual.

CONCLUSIÓN

En la presente práctica determinamos la actividad enzimática de la amilasa, observando que en uno de los tubos de la etapa “B” hubo presencia de sustrato residual, por eso la reacción presentó color azul oscuro; éste sustrato residual se presenta sólo si en los tubos de la etapa “A” no hay de enzima que actúe con su sustrato.

Además observamos que en uno de los tubos de la etapa “C” hay presencia de producto, demostrado por el precipitado color rojo, este producto sólo se presenta si en la etapa “A” hay un enzima que actúe con su sustrato.

ANEXOS

Tubo IA y IIA