PRACTICA: Inhibición del succinato deshidrogenasa

INTRODUCCIÓN

En la presente práctica, investigaremos la inhibición de la actividad enzimática, por productos químicos específicos, los llamados inhibidores. El inhibidor específico usado será malonato.

Una molecular inhibidora afecta la actividad enzimática de dos modos: por inhibición competitiva y por inhibición no competitiva. La inhibición competitiva tiene lugar cuando una molécula que es estructuralmente similar al sustrato para una reacción particular, compite por una posición en el sitio activo de la enzima. Esto hace que el enzima no esté disponible al sustrato. La inhibición competitiva puede invertirse si se eleva la concentración de sustrato a niveles suficientemente altos, mientras la concentración del inhibidor se mantiene constante.

En la inhibición no competitiva, el inhibidor se une al enzima en un sito que no es el sito activo. Siendo así, cambia la naturaleza de la enzima para que pueda perder sus propiedades catalizadoras.

Esto sucede de 2 maneras: El inhibidor no competitivo bloquea físicamente el acceso al sitio activo, o causa un cambio conformacional en la proteína inactivadora. Porque las moléculas de sustrato no pueden invertir la posición de un inhibidor no competitivo, aumentar la concentración de sustrato no invertirá la inhibición.

OBJETIVO

Demostrar el efecto inhibidor de algunas sustancias sobre la velocidad de reacción enzimática, utilizando para ello malonato, como inhibidor del succinato deshidrogenasa.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para ésta práctica utilizamos gradillas, tubos de ensayo, pipetas, Buffer fosfato de sodio, diclorofenolindolfenol, succinato, malonato, homogenizado hepático.

INHIBICIÓN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

Sistemas de incubación y evaluación del efecto inhibidor del malonato

COMPONENTES  (mL)	TUBO 1	TUBO 2	TUBO 3	TUBO 4	TUBO 5
Buffer fosfato de sodio 0.1 M pH 7.4	1.5	1.2	1.0	0.8	0.3
2,6 Diclorofenolindoifenol 0.02%	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
Succinato 0.1 M Succinato 0.5 M	0.2 ----	---- ----	0.2 ----	0.2 ----	---- 0.7
Malonato 0.1 M	----	----	----	0.2	0.2
Homogenizado hepático 20%	----	0.5	0.5	0.5	0.5

 

Mezclamos y dejamos en reposo a temperatura ambiente.

RESULTADOS

·         En el tubo 1 hay tampón o amortiguador, indicador de O-R, sustrato, y sólo se presenta el color del indicador, no hay reacción presenta un color azul transparente debido a que no hay enzima.

·         En el tubo 2 hay tampón o amortiguador, indicador de O-R, enzima, no hay reacción pues no hay sustrato se observa el color del indicador, pero presenta un color azul turbio a diferencia del tubo 1 debido al homogenizado hepático (enzima).

·         En el tubo 3 hay tampón o amortiguador, el indicador, sustrato y enzima considerándose el “IDEAL” pues contiene todo, el succinato aquí se hidrogena por lo tanto se reduce, y pierde ligeramente su color.

·         El tubo 4 contiene el tampón o amortiguador, indicador, inhibidor, enzima pero presenta poca concentración de sustrato, al igual que el inhibidor y al existir una inhibición competitiva se da enzima-inhibidor [EI] la muestra mantienen el color azul del indicador lo cual indica que no se produjo reacción pues es bloqueada por la presencia del inhibidor.

·         En el tubo 5 en comparación con el tubo 4, éste contiene más sustrato menos inhibidor, enzima, indicador; entonces su color varia a un transparente turbio y se demuestra que en la inhibición competitiva se da enzima-sustrato cumpliéndose la teoría que a mayor concentración de sustrato hay mayor posibilidad que se una el sustrato en vez del inhibidor.

DISCUSIÓN

En esta práctica usamos: Buffer fosfato de sodio, como amortiguador para los cambios de pH, 2,6 Diclorofenolindolfenol como indicador oxido-reducción, malonato como inhibidor, homogenizado hepático contiene la enzima,  el succinato (sustrato) para obtener el producto fumarato.

CONCLUSIÓN

Observamos el efecto inhibidor de algunas sustancias sobre algunas de reacciones enzimáticas, utilizando el malonato, y demostrando que en una inhibición competitiva depende de la concentración del sustrato e inhibidor, si hay más concentración de sustrato se desplaza al inhibidor pero si hay más concentración de inhibidor se desplaza al sustrato. El enzima succinato deshidrogenasa actúa con el sustrato succinato formando el fumarato, en la presente practica esta enzima es inhibida por el inhibidor malonato, pero este inhibidor no experimenta proceso catalítico si no pierde un hidrogeno.

ANEXOS

TUBO 1, 2, 3, 4, 5.